Υπεύθυνος: Πανεπιστήμιο Πατρών, Συμμετοχή: Πανεπιστήμιο Κρήτης, ΑΝΔΡΟΜΕΔΑ Α.Ε.
Έναρξη: Μ1 ΛΗΞΗ: Μ36
ΔΙΑΡΚΕΙΑ: 36 μήνες
Στο τέλος της περιόδου νυμφικής εκτροφής, από κάθε υπό παρακολούθηση πληθυσμό θα ληφθεί τυχαίο δείγμα 100-150 νυμφών. Θα ακολουθήσει αναισθητοποίηση (phenoxyethanol), μονιμοποίηση (ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5%) και χρώση των δειγμάτων με αλιζαρίνη και κυανό της Αλσατίας. Τα κεχρωσμένα δείγματα θα εξεταστούν για την ανάπτυξη σκελετικών δυσπλασιών, σύμφωνα με την τυπολογία των Boglione et al. (2013).
Illumina MiSeq Αλληλούχιση
Γενωμικό DNA θα απομονωθεί από ολόκληρες νύμφες τσιπούρας. Η ενίσχυση της περιοχής V3-V4 του 16S rRNA γονιδίου θα πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας τα παρακάτω μόρια εκκινητές: U341F (5’- CCTACGGGRSGCAGCAG-3’) και 805R (5’ GACTACCAGGGTATCTAAT - 3’) (Klindworth et al. 2012). Τα μόρια εκκινητές U341F και 805R περιλαμβάνουν μια μοναδική αλληλουχία σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Nextera βιβλιοθήκης από την Illumina. Οι αντιδράσεις PCR θα πραγματοποιηθούν σύμφωνα με την μεθοδολογία που περιγράφεται από τους Nikolaki & Tsiamis (2013), και Ntougias et al., (2016). Τα προϊόντα ενίσχυσης θα καθαριστούν και θα επαναδιαλυθούν σε 30 μl MilliQ. Η ποσοτικοποίηση των προϊόντων θα πραγματοποιηθεί με το Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) και το Qubit dsDNA High-Sensitivity assay (Life Technologies). Ακολούθως, μία δεύτερη PCR θα εκτελεστεί χρησιμοποιώντας εξειδικευμένους Golay κωδικούς ειδικά για κάθε δείγμα για αποπολυπλεξία της ανάγνωσης. Οι αντιδράσεις θα πραγματοποιηθούν σύμφωνα με την μεθοδολογία που περιγράφεται από τους Ntougias et al., (2016). Τα δείγματα θα καθαριστούν με AMPure XP σφαιρίδια και θα αναμιχθούν σε ισομοριακές συγκεντρώσεις. Οι αλληλουχίες θα προκύψουν σε Illumina MiSeq πλατφόρμα χρησιμοποιώντας το κίτ 300bp paired-end (Illumina). Για κάθε δείγμα τουλάχιστον 50,000 κλώνοι θα αλληλουχηθούν με τεχνολογία αλληλούχισης επόμενης γενιάς (Illumina).
Ανάλυση Δεδομένων
Οι ακατέργαστες αλληλουχίες θα αποπολυπλεχτούν (demultiplexing) και θα μετατραπούν σε FASTQ μορφή. Στη συνέχεια οι Illumina ειδικές αλληλουχίες θα αποκοπούν χρησιμοποιώντας το λογισμικό MSR (Illumina). Η έκδοση Sickle 1.200 (Joshi & Fass 2011) θα χρησιμοποιηθεί για την αποκοπή αλληλουχιών με βάση την ποιότητα τους: οι αλληλουχίες με αποτέλεσμα ποιότητας μικρότερο από 20, ή αυτές που είναι μικρότερες από 10nt, θα απομακρυνθούν από περαιτέρω ανάλυση. Οι αλληλουχίες που θα προκύψουν θα συγκροτηθούν και οι χαμηλής ποιότητας αλληλουχίες θα απομακρυνθούν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα PandaSeq (Masella et al. 2012). Αλληλουχίες μη συγκροτημένες θα απορριφθούν. Όλες οι ακόλουθες αναλύσεις θα πραγματοποιηθούν με την έκδοση 1.9.1 του QIIME . Οι αλληλουχίες στη συνέχεια θα οργανωθούν σε Λειτουργικές Ταξινομικές Μονάδες (Operational Taxonomic Units, OTUs) με το λογισμικό USEARCH (Edgar 2010) με de novo OTU επιλογή. Οι χιμερικές αλληλουχίες θα εντοπιστούν και θα απορριφθούν με το λογισμικό UCHIME με την QIIME-συμβατή έκδοση της βάσης δεδομένων SILVA 111 . Οι πιο διαδεδομένες αλληλουχίες θα επιλεχθούν ως αντιπροσωπευτικές για κάθε OTU. Η ταξινόμηση τους θα πραγματοποιηθεί με βάση αντιπροσωπευτικές αλληλουχίες της βάσης δεδομένων SILVA 111. Πολύ-παραγοντικές αναλύσεις θα πραγματοποιηθούν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Primer6+ (PERMANOVA), όπως και τη γλώσσα R (phyloseq).
Για τον προσδιορισμό της βέλτιστης μεθόδου απολύμανσης τόσο στην παραγωγική διαδικασία όσο και για την εμφάνιση των συμπεριφορικών διαταραχών και των σκελετικών δυσπλασιών θα εφαρμοστούν πέντε διαφορετικές απολυμάνσεις όπως: (α) Acetic acid, (β) Quartenary ammonia, (γ) Calcium oxidea, (δ) Calcium cyanamide, και (ε) EcoLab foam. Η επίδραση των απολυμαντικών στο βακτηριακό προφίλ αλλά και στην εμφάνιση των σκελετικών δυσπλασιών και των συμπεριφορικών διαταραχών θα εξεταστούν όπως περιγράφονται στα ΕΕ1.1 και ΕΕ1.2, με την χρησιμοποίηση νέων τεχνολογιών αλληλούχισης.
Π1.1: Ενδιάμεση Έκθεση Προόδου (18)
Π1.2 Αναφορά για την επιλογή του βέλτιστου απολυμαντικού / βακτηριοστατικού (28)